高保真DNA聚合酶除具有對引物，末端不配對堿基進行錯配修復(fù)功能外 ,對遠(yuǎn)離，末端至數(shù)個堿基位點的錯配堿基也能進行錯配修復(fù)。回答有關(guān)非末端不配對堿基對上述聚合反應(yīng)“關(guān)”系統(tǒng)的影響 ,對深入認(rèn)識高保真酶的保真機制和開發(fā)此“關(guān)”系統(tǒng)的相關(guān)技術(shù) ,具有一定的理論和應(yīng)用價值。我們采用非末端不配對的硫化修飾引物 ,研究其對不同保真度 DNA聚合酶引物延伸反應(yīng)的影響 ,以觀察非末端的錯配堿基能否“關(guān)”閉高保真 DNA聚合酶介導(dǎo)的聚合反應(yīng)。具有外切酶活性的高保真酶的這一維持高保真度的新機制 ,已被不同設(shè)計方案的實驗所證實 ,包括應(yīng)用遠(yuǎn)離三末端的不配對堿基的引物及三末端耐外切酶的引物。這一新的“關(guān)”的機制 ,不但更新和完善了高保真聚合酶的工作原理 ,更為重要的是 ,這一“關(guān)”的效應(yīng)在與耐外切酶消化的硫化磷酸修飾的堿基特異性引物聯(lián)合時 ,構(gòu)成了一種對SNP具有高度辨認(rèn)能力的復(fù)合分子開關(guān)系統(tǒng)。

    高保真DNA聚合酶是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶，以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點開始復(fù)制到3'端的酶。高保真DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、 引物、dNTP 等的情況下）及其相輔的活性。在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用?？赡苁姑傅臉?gòu)象發(fā)生變化，促進3'-OH與5'-PO4結(jié)合生成 磷酸二酯鍵。若是錯誤的核苷酸進入結(jié)合位點，則不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點所識別并切除之。